La alfalfa (L.), un cultivo forrajero importante con alto valor nutricional y buena palatabilidad, juega un papel vital en el desarrollo de la ganadería en China. En el noreste de China, hay vastas áreas de tierras salinas y alcalinas que permanecen sin desarrollar. Dado que la alfalfa es un cultivo forrajero altamente adaptable, explorar su tolerancia a la sal a nivel de transcripción molecular e identificar genes tolerantes a la sal tiene gran importancia para la cría de variedades de alfalfa resistentes a la sal. Esto también proporciona valiosos recursos genéticos para una mejor utilización de las tierras salinas y alcalinas. En este estudio, realizamos dos rondas de selección en 41 variedades de alfalfa e identificamos WL168 como una variedad sensible a la sal y Longmu801 como una variedad tolerante a la sal. Después de 7 días de estrés salino de 300 mM, ambas variedades mostraron una tendencia a la disminución en la altura de la planta, el peso fresco y el peso seco con el tiempo, pero Longmu801 demostró una mejor capacidad de retención de agua en comparación con WL168. El contenido de clorofila también disminuyó, pero los niveles de clorofila a y clorofila total en Longmu801 fueron más altos que en WL168. Los niveles de peróxido de hidrógeno y malondialdehído aumentaron en general, pero Longmu801 tuvo niveles significativamente más bajos que WL168 bajo estrés prolongado. Ambas variedades mostraron tendencias crecientes en azúcares solubles, prolina y enzimas antioxidantes (SOD, POD, CAT), siendo Longmu801 significativamente superior a WL168. Esto sugiere que las dos variedades comparten mecanismos de respuesta de crecimiento y fisiológicos similares, con sus diferencias que surgen principalmente de variaciones en los niveles de los indicadores. En lo anterior, las comparaciones entre variedades se realizaron en función de los valores relativos de los indicadores en relación con sus controles. El análisis transcriptómico reveló que bajo estrés salino, Longmu801 tenía 16,485 genes expresados diferencialmente (DEGs) en relación con su control, mientras que WL168 tenía 18,726 DEGs en comparación con su control. Entre estos, 2164 DEGs compartieron la misma tendencia de expresión, con funciones de GO enriquecidas en respuesta al estrés oxidativo, núcleo, membrana plasmática, entre otros. Las vías de KEGG se enriquecieron en biosíntesis de fenilpropanoides, procesamiento de proteínas en el retículo endoplásmico, metabolismo de almidón y sacarosa, entre otros. Esto sugiere que el mecanismo de respuesta transcripcional de la alfalfa al estrés salino involucra estas vías. Además, los DEGs específicos de la variedad también se enriquecieron en las mismas vías de KEGG y funciones de GO, lo que indica que las diferencias entre las dos variedades provienen de sus DEGs únicos en respuesta al estrés, mientras que sus mecanismos generales para hacer frente al estrés siguen siendo similares. Para identificar más genes relacionados con el estrés salino, este estudio realizó un análisis de WGCNA utilizando 32,683 genes e indicadores fisiológicos. Se identificaron seis módulos estrechamente relacionados con rasgos fisiológicos, y se seleccionaron los cinco principales genes clasificados por grado en cada módulo como genes centrales. Un análisis adicional de estos genes centrales identificó cinco genes directamente relacionados con el estrés salino: , , , , y . El análisis de la prueba de Mantel reveló que estos genes mostraron fuertes correlaciones con indicadores fisiológicos. Este estudio proporcionará importantes perspectivas para la cría de variedades de alfalfa tolerantes a la sal.