Antecedentes: Los eventos de formación ósea y las interacciones osteoblasto/titanio (Ti) pueden verse afectados por las vías de señalización Hedgehog y Notch. En este estudio, investigamos los efectos de la modulación de estas vías de señalización sobre la diferenciación de osteoblastos causada por el Ti nanostructurado (Ti-Nano) generado por HSO/HO. Métodos: Los osteoblastos de calvarias de ratas recién nacidas se cultivaron en Ti-Control y Ti-Nano en presencia del agonista de Hedgehog purmorfamina o del antagonista ciclopamina y del antagonista de Notch N-(3,5-Difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT) o del agonista bexaroteno. La diferenciación de osteoblastos se evaluó mediante la actividad de fosfatasa alcalina y mineralización, y también se evaluó la expresión de los receptores de Hedgehog y Notch. Resultados: En general, la purmorfamina y el DAPT aumentaron, mientras que la ciclopamina y el bexaroteno disminuyeron la diferenciación de osteoblastos y regularon la expresión de receptores en ambas superficies de Ti, con efectos más prominentes en Ti-Nano. La combinación de purmorfamina y DAPT exhibió efectos sinérgicos en la diferenciación de osteoblastos que fueron más intensos en Ti-Nano. Conclusión: Nuestros resultados indicaron que las vías de señalización Hedgehog y Notch impulsan las interacciones osteoblasto/Ti de manera más intensa en nanotopografía. También demostramos que combinar la activación de Hedgehog con la inhibición de Notch exhibe efectos sinérgicos en la diferenciación de osteoblastos, especialmente en Ti-Nano. El descubrimiento de estos mecanismos celulares contribuye a crear estrategias para controlar el proceso de oseointegración basado en el desarrollo de superficies nanostructuradas.