La función biológica más importante de la vitamina B12 es llevar a cabo la síntesis de ADN, que es necesaria para la división celular. La deficiencia de cobalamina puede ser especialmente aguda para las células que se dividen rápidamente, como las células de glioblastoma. Por lo tanto, los antagonistas de cobalamina ofrecen un potencial medicinal para desarrollar agentes anti-glioma. En el presente estudio, desarrollamos un modelo in vitro de deficiencia de cobalamina en células de glioblastoma. Se aplicó un tratamiento a largo plazo de las células con el análogo de cobalamina, hidroxicobalamina [-lactama] (HCCL) para inducir un aumento del biomarcador de hipocobalaminemia. Los ensayos citométricos demostraron que la vitamina B12 promovía la proliferación de células de glioblastoma, mientras que el tratamiento de las células con HCCL causó una inhibición dramática de la proliferación celular y una inducción de la detención del ciclo celular en la fase G2/M. La vitamina B12 contrarrestó todos los efectos observados de HCCL. En el estudio in silico, caracterizamos las interacciones moleculares entre HCCL y transcobalamina II (TCII). Hemos demostrado que HCCL comparte interacciones similares con TCII como las cobalaminas que ocurren naturalmente y, por lo tanto, puede actuar como un inhibidor competitivo de esta proteína transportadora clave. Evaluamos el impacto de HCCL en la mortalidad o malformaciones del desarrollo de embriones de pez cebra. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que el uso de antagonistas del transporte de cobalamina como posibles agentes anti-glioma valdría la pena explorar más a fondo.