Los cultivos de tejidos de plantas medicinales son fuentes potenciales de compuestos bioactivos. En este estudio, informamos sobre la caracterización química de los cultivos de callo de tres especies medicinales, junto con la comparación con brácteas y flores de las mismas especies. Nuestro objetivo era mostrar que los callos de estas especies son buenas alternativas a los callos de otras para la producción de polifenoles y son mejores fuentes de un subconjunto de metabolitos polifenólicos, en comparación con los órganos originales. Los callos se iniciaron a partir de brácteas jóvenes y se cultivaron en un medio de planta leñosa que contenía 1 mg L de 2,4-D y 0.1 mg L de BAP. Para la caracterización química, se realizó un enfoque de metabolómica no dirigida controlada por calidad y la cuantificación de varios compuestos bioactivos utilizando LC-ESI-MS/MS. Mientras que las brácteas y flores contenían glucósidos flavonoides (astragalina, isoquercitrina) como principales polifenoles, los callos de todas las especies contenían catequinas, cumarinas (fraxina, esculina y escopoletina) y agliconas flavánicas. Los callos contenían 5397 ug g de catequina, 201 ug g de esculina, 218 ug g de taxifolina y 273 ug g de eriodictyol, mientras que los callos de otras especies contenían cantidades más bajas. Las flores y brácteas eran ricas en isoquercitrina, conteniendo 8134 y 6385 ug g, respectivamente. Las especies actualmente probadas contenían muchos de los metabolitos bioactivos descritos de otras. La producción de catequina demostró ser comparable a los cultivos de tejidos más eficientes reportados. Las flores y brácteas contenían glucósidos flavonoides, incluyendo tilirosido, que se asemejan a fracciones bioactivas de otras. Además, la metabolómica no dirigida ha mostrado diferencias similares a huellas dactilares entre especies, destacando posibles aplicaciones de quimiotaxonomía y control de calidad, especialmente para las brácteas.