El presente experimento se llevó a cabo para analizar los cambios longitudinales en los microorganismos de la leche. Para este propósito, se recolectaron muestras de leche de 12 vacas sanas (96; seis vacas primíparas y seis vacas multíparas) en ocho momentos diferentes. Las características y variaciones en la composición microbiana se analizaron mediante secuenciación de alto rendimiento del gen 16S rRNA. En el grupo de primíparas, se observó una mayor y más estable diversidad alfa en la leche transitional y madura en comparación con el calostro, sin diferencias significativas en la diversidad alfa en cada momento en el grupo de multíparas. Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidota y Actinobacteriota fueron los filos más dominantes, y los géneros más dominantes en la leche de vacas primíparas y multíparas. Algunos microbios típicamente asociados al intestino, como, etc., se enriquecieron en los dos grupos. Se identificaron taxones biomarcadores con el día en tiempo (DIM) mediante un algoritmo de bosque aleatorio, mostrando el mayor grado de interpretación, y la diferencia en la microbiota de la leche entre los dos grupos se reflejó principalmente en 0 d-15 d. Además, el análisis de red sugirió que había bacterias asociadas con el contenido total de proteínas en la leche. En conjunto, nuestros resultados revelaron los cambios longitudinales en la microbiota de la leche de vacas primíparas y multíparas, proporcionando más evidencia en microbiología láctea.