El cáncer de vejiga (CV) en pacientes que sufren de disfunción neurogénica del tracto urinario inferior (DTUI) es una preocupación significativa debido a su estadio avanzado al diagnóstico y alta tasa de mortalidad. Actualmente, hay una escasez de guías específicas para el cribado de CV en estos pacientes. El desarrollo de biomarcadores urinarios para el CV parece ser un método no invasivo atractivo para el cribado o la estratificación del riesgo en esta población de pacientes. La metilación del ADN es una modificación epigenética, que resulta en el silenciamiento transcripcional de los genes supresores de tumores, que se detecta con frecuencia en la orina de pacientes con CV. Nuestro objetivo fue investigar la hipermetilación del ADN en cinco promotores de genes, previamente asociados con el CV, en la orina de pacientes con DTUI, en comparación con controles sanos. Este fue un estudio de casos y controles prospectivo que reclutó pacientes ambulatorios de neurourología de un hospital docente público que habían sufrido de DTUI durante al menos 5 años. Todos se sometieron a cistoscopia combinada con biopsia para el cribado de CV tras el consentimiento informado por escrito. Se extrajo ADN y se evaluó la metilación del ADN en los promotores de los genes RASSF1, RARbeta, DAPK, TERT y APC mediante PCR cuantitativa específica para metilación en muestras de orina de los pacientes y controles. Se inscribieron 41 pacientes de etiología mixta de DTUI y 35 controles. Se detectó ADN en 36 muestras de orina de pacientes y en 22 de controles. En las muestras de orina, el ADN estaba hipermetilado en al menos uno de los cinco promotores de genes en 17/36 pacientes y en 3/22 controles (47.22% frente a 13.64%, respectivamente, p = 0.009). RASSF1 estaba hipermetilado en 10/17 (58.82%) muestras con metilación detectada, APC en 7/17 (41.18%), DAPK en 4/17 (23.53%), RAR-beta2 en 3/17 (17.56%) y TERT en ninguna. Según un análisis de regresión logística multivariante, la DTUI y el género masculino estaban significativamente asociados con la hipermetilación (OR = 7.43, p = 0.007 y OR = 4.21; p = 0.04, respectivamente). En las muestras de tejido, la histología reveló CV TaLG en dos pacientes y metaplasia escamosa urotelial en cinco pacientes. La inflamación crónica de la vejiga estaba presente en 35/41 biopsias de vejiga. La hipermetilación del ADN en un panel de cinco genes asociados al CV en la orina fue significativamente más frecuente en pacientes con DTUI que en los controles. Nuestros resultados justifican una evaluación adicional en estudios longitudinales que evalúen las implicaciones clínicas y posibles asociaciones entre la hipermetilación del ADN, la inflamación crónica y el CV en la población con DTUI.