Los perfiles de ácidos grasos de los productos derivados de rumiantes están estrechamente asociados con la salud humana. La microbiota ruminal desempeña un papel vital en la modulación de la biohidrogenación (BH) del rumen. El objetivo de este estudio fue evaluar la influencia de la suplementación dietética con florotaninos (PTs) extraídos sobre la fermentación del rumen, la composición de ácidos grasos y las comunidades bacterianas mediante un estudio de cultivo in vitro. La inclusión de PTs en la dieta aumentó la digestibilidad de la materia seca y la producción de gas, y redujo la concentración de amoníaco-N y el pH. El extracto de PT inhibió la BH del rumen, aumentando el contenido de -9 C18:1, -9 C18:1, -9 y -12 C18:2 y reduciendo la concentración de C18:0. La secuenciación de 16S rRNA reveló que los PTs causaron un cambio evidente en las comunidades bacterianas del rumen. La presencia de disminuyó mientras que las bacterias que utilizan carbohidratos como , , , y aumentaron. El análisis de correlación entre la composición de ácidos grasos del rumen y el microbioma bacteriano reveló que , , , , , y podrían haber estado involucrados en el proceso de BH. En conclusión, los resultados sugieren que la inclusión de PTs en la dieta mejoró la fermentación del rumen y la composición de ácidos grasos mediante la modulación de la comunidad bacteriana del rumen.