La barrera hematoencefálica (BHE) es una barrera protectora del sistema nervioso central formada principalmente por células endoteliales que regulan la entrada de sustancias y células al cerebro. Sin embargo, la integridad de la BHE se ve alterada en enfermedades, incluido el cáncer, permitiendo la entrada de sustancias tóxicas, moléculas y células circulantes al cerebro. Este estudio tuvo como objetivo determinar los cambios mitocondriales en las células endoteliales cerebrales co-cultivadas con células cancerosas. Las células endoteliales cerebrales (bEnd.3) fueron co-cultivadas con varias concentraciones de medio condicionado (MC) de cáncer de mama (MCF7) generado en condiciones normóxicas (21% O) e hipóxicas (5% O). Las actividades mitocondriales (incluyendo; actividad de deshidrogenasas, potencial de membrana mitocondrial (m) y generación de ATP) se midieron utilizando el lector de placas Polarstar Omega B.M.G. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se evaluó utilizando el sistema EVOM, seguido de la cuantificación de la expresión génica de las uniones estrechas endoteliales (ETJs) mediante qPCR. Las células bEnd.3 tuvieron una viabilidad celular reducida después de 72 h y 96 h de exposición a MCF7CM en condiciones hipóxicas y normóxicas. El m en las células bEnd.3 se hiperpolarizó después de la exposición a MCF7CM hipóxico (< 0.0001). Sin embargo, el MCF7CM normóxico no afectó significativamente el estado de m en las células bEnd.3. Los niveles de ATP en bEnd.3 co-cultivadas con MCF7CM hipóxico y normóxico se redujeron significativamente (< 0.05). Los cambios en la actividad mitocondrial endotelial cerebral se asociaron con una disminución en la TEER del monocapa de bEnd.3 co-cultivada con MCF7CM bajo hipoxia (= 0.001) y normoxia (< 0.05). Las células bEnd.3 expuestas a MCF7CM aumentaron significativamente el nivel de expresión génica de ETJs (< 0.05). MCF7CM modula la actividad mitocondrial en las células endoteliales cerebrales, afectando la función de la barrera endotelial cerebral.