Este estudio se centra en la optimización de las técnicas de extracción de clorofila, en las que se cortan discos de hojas de lugares en la lámina foliar para aumentar la concentración de clorofila en las hojas de sésamo (L.). Se seleccionaron treinta genotipos de sésamo, categorizados en grupos de pigmentos de verde claro (LG), verde medio (MG) y verde oscuro (DG) según la coloración de las hojas, de un grupo más amplio de accesiones cultivadas en campo. La investigación involucró la determinación de mediciones óptimas del índice de valor del análisis de plantas del suelo (SPAD), la cuantificación de las concentraciones de pigmentos, la exploración de disolventes de extracción y la selección de posiciones adecuadas para los discos de hojas. Se observaron variaciones significativas en el contenido de clorofila entre los genotipos, las categorías de verdor y las posiciones de los discos de hojas. La categorización de los genotipos en grupos DG, MG y LG reveló una correlación entre la apariencia de las hojas y el contenido de clorofila. El estudio destacó una relación consistente entre los carotenoides y la clorofila, indicando su papel en la adaptación a ambientes cálidos. Un examen de las posiciones de los discos de hojas reveló un gradiente significativo de clorofila a lo largo de la lámina foliar, enfatizando la necesidad de protocolos estandarizados. Los experimentos de extracción de clorofila identificaron DMSO y etanol al 96%, particularmente en aquellos incubados durante 10 minutos a 85 grados C, como opciones efectivas. Esta recomendación considera factores como la rentabilidad, la eficiencia temporal, la seguridad y las regulaciones ambientales, asegurando procesos de extracción consistentes y simplificados. Para una mayor extracción de clorofila, se sugiere centrarse en las puntas de las hojas y la localización del 75% a lo largo de la lámina foliar del sésamo, ya que esto produce consistentemente un aumento en el contenido de clorofila. Además, nuestro examen reveló variaciones anatómicas significativas en la estructura interna del tejido mesofílico de las hojas entre las plantas de sésamo de verde oscuro y verde claro, principalmente vinculadas a la densidad de cloroplastos y las estructuras productoras de pigmentos. Por lo tanto, nuestros hallazgos proporcionan un conocimiento perspicaz sobre los gradientes de clorofila y fomentan el uso de protocolos estandarizados que permiten a los investigadores refinar sus diseños experimentales para mediciones precisas y comparables de clorofila. Las opciones de disolventes recomendadas aseguran resultados confiables en fisiología vegetal, ecología y estudios ambientales.