Los avances en las Tecnologías de Reproducción Asistida (TRA) aplicadas en especies de camélidos sudamericanos son aún escasos. El objetivo de este estudio fue comparar los efectos de tres diluyentes de semen, antes y después de la criopreservación de los espermatozoides obtenidos del conducto deferente, sobre los parámetros de calidad del esperma y las tasas de fertilización in vitro de los ovocitos de llama. Machos de llama fértiles y maduros fueron incluidos en el estudio. Se recolectaron muestras de esperma de cada macho utilizando la técnica quirúrgica de desviación del conducto deferente. Luego, las muestras de esperma se agruparon y diluyeron con el diluyente Tris-EY, Andromed o BioxCell para llevar a cabo posteriormente el proceso de criopreservación del esperma. La evaluación de la calidad del esperma relacionada con cada diluyente se realizó antes y después de la criopreservación en relación con las anomalías morfológicas del esperma, la integridad del acrosoma, la viabilidad del esperma, la permeabilidad de la membrana y los rasgos de motilidad del esperma. Además, se llevaron a cabo procedimientos de fertilización in vitro (FIV) para evaluar la fertilidad in vitro de las muestras de esperma criopreservadas utilizando cada diluyente. En general, se observaron diferencias significativas antes y después de la criopreservación en relación con la integridad del acrosoma, la viabilidad del esperma, la permeabilidad de la membrana y los rasgos de motilidad del esperma entre los diluyentes utilizados, donde Tris-EY y Andromed fueron mejores que BioxCell; sin embargo, no se observaron diferencias en relación con las anomalías morfológicas del esperma entre los diluyentes. Además, se observaron múltiples diferencias en relación con los parámetros cinemáticos de velocidad y linealidad obtenidos mediante análisis computarizado antes y después del proceso de criopreservación, independientemente del diluyente utilizado. Finalmente, se observaron diferencias en las tasas de fertilización in vitro entre las diferentes muestras derivadas de los diluyentes. En conclusión, la calidad del esperma utilizando Tris-EY y Andromed fue mejor antes y después de la criopreservación en comparación con la que utilizó BioxCell. Aunque el número de ovocitos fertilizados obtenidos después del proceso de FIV entre Tris-EY y Andromed fue similar, las muestras derivadas de Andromed mostraron los mejores resultados de calidad del esperma antes y después de la criopreservación. Esto indica que el diluyente de criopreservación es un factor determinante para mejorar significativamente las tasas de fertilización in vitro al utilizar muestras de esperma obtenidas del conducto deferente en machos de llama.