La alfalfa (L.) es una leguminosa forrajera valiosa, pero su producción se ve ampliamente afectada por altas temperaturas. En este estudio, investigamos el efecto del estrés por calor en 15 cultivares de alfalfa para identificar cultivares tolerantes y sensibles al calor. Las plántulas fueron expuestas a una temperatura de día/noche de 38/35 grados Celsius durante 7 días y se midieron varios parámetros. El estrés por calor redujo significativamente la biomasa, el contenido relativo de agua (RWC), el contenido de clorofila, y aumentó la fuga de electrolitos (EL) y el contenido de malondialdehído (MDA) de los cultivares de alfalfa sensibles al calor. Sin embargo, los cultivares tolerantes al calor mostraron un mayor contenido de azúcares solubles (SS) y proteínas solubles (SP). La tolerancia al calor de cada cultivar fue evaluada de manera integral en función del valor de la función de pertenencia. Los cultivares con un valor de función de pertenencia promedio más alto de 0.86 (Bara310SC) y 0.80 (Magna995) fueron tolerantes al calor, y Gibraltar y WL712 con un valor de función de pertenencia más bajo (0.24) fueron sensibles al calor. La tolerancia al calor de los cuatro cultivares mencionados anteriormente fue evaluada además mediante análisis de fluorescencia de clorofila. El estrés por calor afectó significativamente la actividad fotosintética de los cultivares sensibles al calor. En general, los resultados indican que Bara310SC y WL712 son cultivares tolerantes y sensibles al calor, respectivamente. Este estudio proporciona información básica para comprender el efecto del estrés por calor en el crecimiento y la productividad de la alfalfa.