En la práctica clínica, es común recolectar muestras de semen del mismo perro en el mismo día o en días consecutivos, especialmente para la criopreservación o la inseminación artificial. En tales casos, es necesario repetir el análisis de semen para cada eyaculado. Para reducir los recursos humanos y económicos involucrados, se necesitan nuevos estudios sobre la calidad del semen y las variaciones en los marcadores a lo largo del tiempo. ProAKAP4 es un componente esencial de la arquitectura de la cola de los espermatozoides, involucrado en la motilidad espermática y un marcador de la calidad del semen. El presente estudio evalúa su variación a lo largo del tiempo en muestras de semen subsiguientes recolectadas de los mismos perros. Catorce perros machos (12 razas diferentes, de 1 a 14 años y de 6.9 a 95 kg de peso corporal) se sometieron a la recolección de semen en varios momentos: primera recolección de muestras de semen, 2-3 horas y/o 1-30 días después de la primera recolección de semen. En nuestro estudio, la concentración de proAKAP4 no parece variar en los eyaculados recolectados del mismo perro en diferentes momentos, y se correlacionó significativamente con la motilidad total. Confirmamos que proAKAP4 es un biomarcador relevante, específico y estable de la motilidad total de los espermatozoides. Este resultado impulsa más estudios multicéntricos sobre un mayor número de perros y resultados de fertilidad antes de que se pueda traducir con confianza en la clínica.