La equilibración con un extensor es necesaria para permitir la criopreservación del esperma bovino. El objetivo del ensayo 1 fue evaluar el efecto de 24 h frente a 4 h de tiempo de equilibración con tres extensoras diferentes sobre la calidad del esperma y seleccionar el extensor preferido para cada toro. El objetivo del ensayo 2 fue investigar el efecto de utilizar un tiempo de equilibración de 24 h con un extensor específico para cada toro sobre la fertilidad en el campo. Para el ensayo 1, se utilizaron tres eyaculados de cada uno de ocho toros de cría Holstein Friesian como muestra dividida, incluyendo dos tiempos de equilibración (4 h y 24 h) y tres extensoras (BioXcell, Triladyl y OptiXcell). Para el ensayo 2, se recolectaron y trataron de 5 a 10 eyaculados de los mismos toros (muestra dividida) como BioXcell con 4 h de equilibración y ya sea Triladyl u OptiXcell, ambos con 24 h de equilibración. Se utilizaron un total de 11,059 pajillas para la inseminación de vacas y novillas. Para Triladyl, la motilidad progresiva del esperma, los defectos del acrosoma y la integridad de la membrana plasmática y del acrosoma mejoraron con 24 h en comparación con 4 h de tiempo de equilibración. Se utilizaron cuatro toros cada uno con Triladyl y OptiXcell para el ensayo 2. En el ensayo 2, las tasas de no retorno no difirieron entre los grupos. Por lo tanto, utilizar un tiempo de equilibración de 24 h podría mejorar los parámetros del esperma in vitro, dependiendo del extensor utilizado. Además, sería posible cambiar de 4 h a 24 h de tiempo de equilibración sin perjudicar la fertilidad en el campo.