(L.) Weber ex F.H. Wigg, comúnmente conocido como diente de león, es una maleza cosmopolita y perenne, que tiene propiedades medicinales. Los métodos de propagación in vitro son ampliamente utilizados en plantas que tienen dificultades en su cultivo y, consecuentemente, bajos rendimientos de extracción de metabolitos activos. Por lo tanto, el cultivo de callos se ha considerado útil para la acumulación de varios metabolitos. En este estudio, nuestro objetivo fue establecer un protocolo eficiente para la inducción y mantenimiento de callos, para lo cual se evaluaron el tipo de explante, la fuente de carbono, las condiciones de luz y nueve combinaciones diferentes de reguladores del crecimiento vegetal (PGRs), como ácido 1-naftalenacético (NAA) (de 0.05 a 0.5 mg/L) y ácido 6-bencilaminopurina (BAP) (de 0.5 a 3.0 mg/L). Los resultados mostraron que los hipocotilos y raíces de plántulas estériles son las mejores fuentes para la inducción de callos, con un 100% de calogénesis en cada condición probada, y más del 95% de viabilidad y friabilidad. La oscuridad completa y un medio suplementado con sacarosa al 2.3% (/) y 0.5 mg/L de NAA y 0.5 mg/L de BAP fueron las mejores condiciones para la inducción de callos, mostrando callos con baja organogénesis y alta friabilidad. Este estudio proporciona una base para futuros estudios sobre la mejora de la propagación de callos a gran escala y el establecimiento de sistemas de cultivo en suspensión para fines comerciales.