La alfalfa es un cultivo leguminoso económico distribuido globalmente, utilizado para forraje y restauración ecológica. Nuestro objetivo fue explorar los mecanismos subyacentes a la aclimatación al frío observada en esta especie. Nuestros resultados para el crecimiento de plantas en otoño mostraron que la alfalfa no dormida (SD) mantuvo una tasa de crecimiento vigorosa en comparación con la alfalfa dormida en otoño (ZD); sin embargo, la tasa de supervivencia invernal de ZD fue mayor que la de SD. Entre las muestras de ZD, el contenido de almidón primero se acumuló y luego disminuyó; el contenido de sacarosa se consumió primero junto con la acumulación simultánea de rafinosa, que fue seguida por la acumulación de contenido de sacarosa, con cambios consistentes en la actividad de las respectivas sintasas e hidrolasas relacionadas. SD mostró la tendencia opuesta. Los datos del transcriptoma mostraron que la mayoría de los genes expresados diferencialmente estaban involucrados en el metabolismo del carbono (ko01200), la biosíntesis de aminoácidos (ko01230) y el metabolismo de almidón y sacarosa (ko00500). Nuestros datos muestran claramente que el mecanismo de aclimatación al frío de la alfalfa es un proceso complejo, con el establecimiento de una homeostasis de carbono estable; la sacarosa se convierte primero en almidón y rafinosa, y luego, el almidón se convierte en sacarosa, lo que permite la resistencia al frío de la alfalfa. El proceso está acompañado por la regulación del factor de transcripción CBF/DREB1A. Este estudio proporciona importantes conocimientos sobre los mecanismos de aclimatación al frío de la alfalfa.