La grasa hepática excesiva causa enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) en gallinas ponedoras, reduciendo la producción de huevos. Abordar la EHGNA a través del metabolismo de los ácidos biliares está ganando atención. Indujimos EHGNA en gallinas ISA hembras de 7 semanas con una dieta alta en colesterol y baja en colina (CLC) durante 6 semanas. Se utilizó LC/MS para analizar los ácidos biliares en suero y ciego, mientras que el ADN del contenido cecal se sometió a secuenciación de 16S rRNA. La distribución de los ácidos biliares varió en gallinas sanas (CON) y en gallinas alimentadas con CLC. CLC aumentó los ácidos biliares secundarios (TLCA, TUDCA, THDCA, TDCA) en suero y los ácidos biliares primarios (CDCA, TCDCA, isoDCA) en suero, así como el ácido glicoceno-deoxicólico (GCDCA) en los contenidos cecales. CLC reguló al alza las enzimas de síntesis de ácidos biliares (CYP7A1, CYP8B1) en el hígado. La expresión génica del receptor de ácidos biliares (HNF4A, FXR, LXR) fue similar entre los grupos. La abundancia de microbiota fue más rica en CON (diversidad alfa), con una separación distinta (diversidad beta) entre CON y CLC. La relación Firmicutes/Bacteroidetes disminuyó ligeramente en CLC. El análisis taxonómico reveló un mayor número de en CLC pero un menor número de . CLC tenía más Mucispirillum, Eubacterium_coprostanoligenes_group, Shuttleworthia y Olsenella, mientras que CON tenía más Enterococcus, Ruminococcaceae_UCG_014 y Faecalibacterium. Este estudio revela cambios en los ácidos biliares y la microflora en un modelo de EHGNA en gallinas, mejorando nuestra comprensión del metabolismo de la enfermedad del hígado graso y ayudando en intervenciones específicas.