Debido a las enormes pérdidas económicas en la industria láctea a nivel mundial, la mastitis puede considerarse una de las enfermedades más comunes en las vacas lecheras. Este trabajo tuvo como objetivo estudiar esta enfermedad comparando múltiples muestras biológicas (heces, suero y orina) de individuos con o sin mastitis clínica. Esto se realizó mediante una única plataforma analítica, a saber, H-NMR, a través de una estrategia de múltiples matrices. Gracias a la alta reproducibilidad de H-NMR, pudimos caracterizar 120 moléculas en las heces, suero y orina de vacas lecheras. Entre ellas, 23 moléculas fueron comunes en los tres biofluidos. Al integrar los resultados de la metabolómica de múltiples matrices, varios caminos relacionados con el metabolismo energético y el metabolismo de aminoácidos parecieron verse afectados por la mastitis clínica. El presente trabajo deseaba profundizar en la comprensión de la mastitis en vacas lecheras en su forma clínica. El análisis simultáneo de los cambios en el metaboloma a través de varios biofluidos clave podría facilitar el descubrimiento de conocimientos y la identificación confiable de biomarcadores potenciales, que a su vez podrían utilizarse para arrojar luz sobre el diagnóstico temprano de la mastitis en vacas lecheras en su forma subclínica.