En el presente estudio evaluamos la citotoxicidad del agua superoxidada en fibroblastos gingivales humanos y su eficacia en la eliminación de residuos y capa de barro de las paredes del conducto radicular. Los fibroblastos gingivales cultivados fueron expuestos a agua superoxidada (Sterilox), que se diluyó en el medio modificado de Dulbecco de Iscove (IMDM) en concentraciones del 30%, 40%, 50%, 60% y 70%. El grupo de control se mantuvo en IMDM. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT después de períodos de incubación de 1 h, 2 h, 24 h y 48 h. También se observaron cambios celulares patológicos bajo microscopios de fluorescencia y contraste de fase. La eficacia en la eliminación de residuos y capa de barro se evaluó en comparación con la aplicación convencional de hipoclorito de sodio (NaOCl) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Cuarenta premolares maxilares se dividieron aleatoriamente en dos grupos iguales (n = 20) y se moldearon con instrumentos rotatorios ProTaper NEXT utilizando Sterilox o NaOCl/EDTA para la irrigación. Posteriormente, las raíces se dividieron longitudinalmente y se examinaron bajo un microscopio electrónico de barrido. Los resultados revelaron que el agua superoxidada y el agua destilada estéril tienen propiedades biológicas aceptables para aplicaciones endodónticas en concentraciones de hasta el 50% (p > 0.05). Además, el agua superoxidada es igualmente efectiva en la eliminación de residuos y capa de barro en comparación con NaOCl/EDTA (p > 0.05).