Los pepinos son un importante cultivo de hortalizas a nivel económico que se utiliza para consumo fresco o procesamiento en todo el mundo. En este estudio, se utilizaron 264 accesiones que consistían en germoplasmas silvestres de todo el mundo y líneas de mejoramiento avanzadas para comprender la diversidad genética y la correlación genética entre la colección de germoplasma. Se aplicó un enfoque de genotipado por secuenciación (GBS) para obtener una cobertura densa de marcadores en todo el genoma (>12,082 SNPs) y construir un mapa de haplotipos de alta densidad. Se realizaron varios métodos de estratificación de poblaciones y se dividieron en tres subgrupos basados en la diversidad genética, que reflejaba sus regiones geográficas. Según el análisis filogenético, las líneas de mejoramiento se separaron de los germoplasmas silvestres, y los dos grupos distintos se dividieron dentro de las líneas de mejoramiento. Uno de los grupos consistía principalmente en variedades del este asiático, que mostraban patrones genotípicos homogéneos únicos. Utilizando esta colección de germoplasma, se evaluaron tres importantes rasgos hortícolas de los pepinos: resistencia al oídio, color de las espinas y color del extremo del tallo del fruto, y se utilizaron para realizar un estudio de asociación a nivel genómico (GWAS). Se identificaron todos los SNPs significativos y dos nuevos genes candidatos ( y ) para el oídio en el cromosoma 5 de la población natural, donde se encuentran los QTLs principales informados de varias poblaciones biparentales. Además, se identificaron dos genes candidatos, y , y cuatro genes candidatos, , , , y , para el color de las espinas y el color del extremo del tallo del fruto, respectivamente. Se espera que estos resultados sean útiles para desarrollar marcadores moleculares de los rasgos hortícolas en los pepinos.