Los biofilms representan actualmente el estilo de vida bacteriano más prevalente, lo que les permite resistir el estrés ambiental y los medicamentos antibacterianos. Los agentes antibacterianos naturales podrían ser una solución segura para controlar los biofilms bacterianos en las industrias alimentarias sin afectar la salud humana y la seguridad ambiental. Se preparó un extracto metanólico de hojas de neem y se analizó utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas para la identificación de sus constituyentes fitoquímicos. Se probaron cuatro patógenos bacterianos de origen alimentario para la formación de biofilm cualitativa y cuantitativamente. Se estimaron las propiedades antibacterianas y antibiofilm del extracto utilizando cultivos líquidos y un ensayo en placa de microtitulación. Se investigaron los mecanismos de inhibición del biofilm utilizando un microscopio óptico y la técnica de acoplamiento molecular. El extracto metanólico contenía 45 compuestos identificados, incluidos ácidos grasos, ésteres, fenoles, flavonoides, terpenos, esteroides y antioxidantes con propiedades antimicrobianas, anticancerígenas y antiinflamatorias. Se registró una actividad antibacteriana sustancial en relación con el extracto, especialmente a 100 g/mL contra ciertos patógenos. El extracto inhibió la formación de biofilm a 100 g/mL en un 83.83%, 73.12% y 54.4%. Los resultados indican una formación eficiente de biofilm por las bacterias Gram-negativas, dando 0.74, 0.292 y 0.219 OD a 595 nm, respectivamente, mientras que se encontró que tenía un bajo potencial de formación de biofilm, es decir, 0.14 OD a 595 nm. La técnica del microscopio óptico muestra las actividades antibiofilm con el biofilm casi desapareciendo a concentraciones de 75 g/mL y 100 g/mL. Esta propiedad antibiofilm se atribuyó a la inhibición de la ADN girasa, como se ilustra mediante el enfoque de acoplamiento molecular.