El orujo de oliva agotado (EOP) representa el principal residuo del orujo de oliva. Varios estudios han optimizado la extracción de metabolitos especializados del EOP de L., pero no se ha realizado una comparación entre diferentes métodos extractivos. Por esta razón, la presente investigación tiene como objetivo comparar cuatro métodos extractivos diferentes utilizando agua y 15% de etanol/agua como disolventes extractivos. Específicamente, basándose en la actividad antioxidante del extracto, los métodos comparados fueron maceración (MAC), extracción asistida por microondas (MAE), extracción asistida por ultrasonido (UAE) y extracción acelerada de disolventes (ASE). Entre estos, se demostró que los extractos hidroalcohólicos de EOP de UAE y ASE tenían la mayor actividad antioxidante. Posteriormente, se investigaron estos extractos por su actividad hipoglucémica y antiradical utilizando ensayos in vitro sin células y basados en células, respectivamente. El extracto hidroalcohólico de EOP de ASE demostró la mayor capacidad para inhibir la enzima alfa-amilasa y una actividad antioxidante in vitro comparable a la N-acetilcisteína en células HepG2. También se realizó la caracterización fitoquímica de los extractos de UAE y ASE, identificando siete compuestos fenólicos, incluyendo 3-hidroxitirsol, tirsol y, por primera vez, salidrosido. El extracto hidroalcohólico de EOP de ASE fue el más rico desde un punto de vista fitoquímico, confirmando así su mayor actividad biológica. Por lo tanto, ASE y 15% de etanol/agua pueden representar el mejor método extractivo para la valorización nutracéutica del EOP.