El estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de los niveles de oligosacáridos de quitosano (COS) en la dieta sobre la tasa de desaparición de nutrientes, la fermentación en el rumen y la microflora de ganado vacuno in vitro. Un total de 24 tanques de fermentación se dividieron aleatoriamente en cuatro tratamientos que contenían 0% COS (CON), 0.02% COS, 0.04% COS y 0.08% COS durante un período de experimento de 8 días, con cada tratamiento compuesto por seis réplicas. Las tasas de desaparición de MS, PC, EE y la producción total de gas aumentaron cuadráticamente con el aumento de los niveles de COS. Las tasas de desaparición de MS, PC, EE y ADF fueron las más altas, mientras que la producción total de gas fue la más baja en el grupo de 0.08% COS. El pH, NH-N, MCP, el contenido de propionato, isobutirato, butirato, valerato y la relación A/P aumentaron cuadráticamente con el aumento de los niveles de COS, mientras que la relación A/P disminuyó linealmente. El pH, MCP y el contenido de propionato y butirato fueron los más altos, mientras que el NH-N y el contenido de acetato, isobutirato, valerato y la relación A/P fueron los más bajos en el grupo de 0.08% COS. El análisis microbiómico mostró que la diversidad microbiana del rumen no se alteró entre el grupo CON y el grupo de 0.08% COS. Sin embargo, la abundancia relativa de los grupos aumentó, y la abundancia relativa de bacterias patógenas mostró una disminución en el grupo de 0.08% COS. En general, el 0.08% COS fue el más efectivo entre los tres niveles de adición, resultando en un aumento en la tasa de desaparición de nutrientes fermentados in vitro y mejoras en los índices de fermentación del rumen y comunidades microbianas. Esto, a su vez, condujo al mantenimiento de la salud del rumen.