Los oligosacáridos derivados de la pared celular de las plantas, como los xilo-oligosacáridos (XOS), sirven como moléculas de señalización clave que regulan el crecimiento y la inmunidad de las plantas. La bioactividad de los XOS está estrechamente relacionada con su grado de polimerización (DP), sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos específicos del DP siguen siendo poco comprendidos. Aquí, investigamos las respuestas transcripcionales y fenotípicas de la lechuga a la aplicación foliar de cuatro variantes de XOS de alta pureza: xylobiosa (XOSY, DP2), xylotriosa (XOSB, DP3), xylotetraosa (XOSD, DP4) y xylopentosa (XOSW, DP5). Los análisis fenotípicos revelaron que los XOS de alto DP (XOSD y XOSW) mejoraron significativamente la biomasa aérea y el desarrollo del sistema radicular, siendo XOSD el que mostró los efectos más pronunciados, incluyendo un aumento del 31.74% en el área foliar y un aumento del 20.71% en la biomasa aérea. El perfil transcriptómico identificó una extensa reprogramación transcripcional a través de los tratamientos, siendo XOSD el que provocó el mayor número de genes expresados diferencialmente (DEGs). Los análisis de enriquecimiento funcional indicaron que XOSD y XOSW regulaban al alza genes involucrados en la señalización hormonal de las plantas, el metabolismo del almidón y la sacarosa, y la biosíntesis de la pared celular, mientras que regulaban a la baja genes relacionados con la fotosíntesis. Notablemente, los análisis de rutas de MapMan y KEGG revelaron que XOSD activó significativamente rutas relacionadas con el estrés biótico, incluyendo la señalización MAPK, la actividad de beta-1,3-glucanasa y las vías de proteínas PR. En contraste, el tratamiento con XOSY reguló principalmente al alza genes vinculados a la inmunidad basal, destacando los mecanismos distintos empleados por los XOS de bajo y alto DP. Estos hallazgos demuestran que los XOS con diferentes DP modulan de manera diferencial los procesos relacionados con el crecimiento y la inmunidad en la lechuga. Los XOS de alto DP, particularmente XOSD, no solo promueven la acumulación de biomasa en las plantas, sino que también mejoran las respuestas inmunitarias, destacando su potencial como biostimulantes para la agricultura sostenible. Este estudio proporciona un marco molecular para comprender la bioactividad específica del DP de los XOS y su doble papel en la optimización del crecimiento y la defensa de las plantas.