La peroxidasa (PO) se ha aplicado en diferentes áreas de la biotecnología industrial, incluyendo el control de contaminantes como la aflatoxina B en piensos para peces. Sin embargo, sus posibles interacciones negativas con los componentes macro y micro de los piensos no han sido evaluadas. El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto de la adición de PO a un pienso sobre compuestos como ácidos grasos y polifenoles utilizando una simulación in vitro del tracto digestivo de la tilapia. La influencia sobre los ácidos grasos se determinó mediante cambios en el índice de peróxido, siendo el pienso que incluía PO cuatro veces más alto que el del pienso de control. Por otro lado, la simulación digestiva in vitro también evidenció un efecto de la PO sobre la bioaccesibilidad de los polifenoles, significativamente influenciada por el tiempo total de digestión y la temperatura. La bioaccesibilidad de los polifenoles osciló entre 2.09 y 16.23 mol de la capacidad antioxidante total equivalente a Trolox para las combinaciones evaluadas en el estudio. La mayor bioaccesibilidad se observó en el punto central bajo las siguientes condiciones de hidrólisis digestiva: pH de 7, 30 grados C, 4.5 h de hidrólisis digestiva y ausencia de PO.