Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), contaminantes acuáticos prevalentes, surgen de la quema de combustibles fósiles, una fuente importante de gases de efecto invernadero que impulsan el calentamiento global. Los HAP y las temperaturas más cálidas ejercen individualmente diversos efectos negativos sobre los organismos acuáticos. Sin embargo, los efectos de la exposición a HAP y/o el aumento de la temperatura siguen siendo en gran medida desconocidos. Se han empleado modelos de hígado in vitro, como la línea celular de hígado de trucha arcoíris RTL-W1, para desentrañar los efectos de la exposición a HAP, principalmente sobre la viabilidad celular y la actividad enzimática. Aquí, se utilizaron células RTL-W1 cultivadas en monocapa (2D) para evaluar los efectos de coexposición de temperatura (18 y 21 grados C) y dos HAP, benzo[a]pireno (B[a]P) y benzo[k]fluoranteno (B[k]F), a 10 y 100 nM. Después de una exposición de 72 h, se evaluaron la densidad celular y la viabilidad utilizando los ensayos de azul de trypan y LDH. Los niveles de ARNm de los genes asociados a la desintoxicación se midieron por RT-qPCR. La temperatura influyó en la viabilidad celular y la fuga de LDH. Ambos HAP redujeron la densidad celular y aumentaron los niveles de ARNm de ciertos genes, mientras que otros solo se incrementaron después de la mayor concentración de B[k]F. La temperatura influyó en la expresión de algunos genes. No hubo interacción entre la temperatura y los HAP. En general, los resultados muestran que B[k]F tiene más efectos sobre los objetivos de desintoxicación que B[a]P, mientras que un aumento de temperatura afecta levemente la expresión génica. El RTL-W1 en 2D parece útil para desentrañar no solo los efectos hepáticos de los HAP, sino también el impacto del estrés térmico.