El desarrollo de células multinucleadas es crítico para la maduración y función de los osteoclastos (OCs). Nuestro objetivo fue ampliar el conocimiento sobre la osteoclastogénesis, centrándonos en el tiempo y comportamiento de la fusión de pre-OCs. Las células RAW 264.7, que son una línea celular de monocitos-macrófagos murinos, proporcionan una herramienta valiosa y ampliamente utilizada para estudios in vitro sobre los mecanismos de osteoclastogénesis. Las células fueron tratadas con el ligando activador del receptor del factor nuclear -B (RANKL) durante 1-4 días y se examinaron los efectos en la morfología celular, organización del citoesqueleto, distribución de proteínas y expresión génica específica de OCs mediante TEM, inmunofluorescencia y qPCR. Las células multinucleadas comenzaron a aparecer a los dos días de estimulación con RANKL, aumentando en número y tamaño en los días siguientes, asociadas con cambios en la organización morfológica y del citoesqueleto. Se observaron extensiones celulares interesantes en tres días dentro de células etiquetadas con aglutinina de germen de trigo (WGA)-isotiocianato de fluoresceína (FITC). La distribución de RANK, TRAF6, p-p38, pERK1/2 y NFATc1 en la membrana, citoplasma o núcleo, respectivamente, se relacionó con el tiempo de maduración de los OCs. La expresión génica de factores de transcripción que regulan la osteoclastogénesis, moléculas involucradas en la transducción de señales de RANKL, regulación del citoesqueleto, fusión, migración y enzimas específicas de OCs, mostró diferentes tendencias relacionadas con el tiempo de diferenciación de los OCs. Nuestros hallazgos proporcionan una visión integrada sobre los cambios morfológicos y moleculares que ocurren durante la estimulación con RANKL de las células RAW 264.7, lo cual es importante para comprender mejor los procesos de maduración de los OCs.