La gestión de los recursos hídricos es uno de los desafíos más importantes a nivel mundial porque el agua representa un recurso vital para sostener la vida y el medio ambiente. Con el objetivo de una gestión sostenible de las aguas subterráneas, la identificación de las áreas de recarga de acuíferos es una herramienta útil para la protección de los recursos hídricos. En un acuífero kárstico bien desarrollado, los isótopos ambientales apoyan la identificación de las áreas de recarga de acuíferos, el tiempo de residencia y las interconexiones entre sistemas de acuíferos. Este estudio trata sobre el uso de isótopos ambientales para identificar la principal área de recarga de un acuífero kárstico en el Alto Valle del río Aniene (Italia central). El análisis de los valores de O/O y H/H y su distribución espacial permite rastrear las áreas de recarga de aguas subterráneas basándose en las elevaciones promedio de isótopos. Se utilizó el Método de Balance Hidrogeológico Inverso para validar las elevaciones de recarga de manantiales obtenidas mediante el uso de isótopos estables. Se delinearon las áreas impactadas por la recarga directa y rápida de la lluvia en el área de estudio, mostrando las trayectorias de flujo de aguas subterráneas desde los límites hasta el núcleo del acuífero. Los resultados de este estudio demuestran la contribución que los cambios isotópicos espaciales y temporales pueden proporcionar a la identificación de las trayectorias de flujo de aguas subterráneas en una cuenca kárstica, teniendo en cuenta el contexto hidrogeológico.