Se ha informado que el rendimiento reproductivo del esperma de caballo y del esperma de burro difiere. Las proteínas del esperma juegan un papel crucial en la viabilidad y fertilidad del esperma. Aunque se conocen diferencias entre especies, ningún estudio previo ha investigado las disparidades en el proteoma del esperma entre caballos y burros. Por lo tanto, este estudio caracterizó y comparó los proteomas del esperma de caballos y burros utilizando tecnología de espectrometría de masas 4D-DIA. Identificamos 3436 proteínas en el esperma de caballo y 3404 proteínas en el esperma de burro. De estas, 3363 proteínas se expresaron tanto en el esperma de caballo como en el de burro, con 73 proteínas expresadas específicamente en el esperma de caballo y 41 en el esperma de burro. Según el análisis de datos, los burros exhibieron un mayor porcentaje de motilidad y movimiento progresivo en el esperma en línea recta que los caballos, así como porcentajes más bajos de esperma estático y lento que los caballos. El análisis conjunto de los resultados de los proteomas del esperma de caballo y burro y sus parámetros de lectura CEROS II demostró una posible asociación entre las proteínas del esperma y sus patrones de viabilidad del esperma. Estos hallazgos sugieren que existen discrepancias en los niveles de expresión y composiciones de proteínas del esperma de caballo y burro y que ciertas proteínas específicas pueden ser responsables de las diferencias en el rendimiento entre estas dos especies.