El estudio evaluó el impacto de cuatro técnicas de procesamiento de semen equino en la calidad del esperma y la carga microbiana inmediatamente después del procesamiento y tras 48 horas de refrigeración. El objetivo era explorar la posible reducción del uso de antibióticos profilácticos en los diluyentes de semen. Se recolectó y procesó semen de diez sementales adultos bajo un estricto protocolo de higiene y se dividió en cuatro alícuotas: Centrifugación Simple con antibióticos (SC+), Centrifugación Simple (SC-), Centrifugación Coloidal de Capa Única (CC-) y Filtración (con SpermFilter) (F-), todos en diluyentes sin antibióticos. Se evaluaron la motilidad, viabilidad y carga microbiana en tres medios de cultivo. No se observaron diferencias significativas en los principales parámetros de calidad del esperma entre los cuatro protocolos después del procesamiento y a las 48 horas (< 0.05 o < 0.1). Las cargas microbianas en el medio Columbia 5% Agar de Sangre de Oveja y en el medio Schaedler vitamina K1 5% Agar de Sangre de Oveja fueron significativamente más altas (< 0.10) para el semen crudo que para CS+, CC- y F- después del procesamiento. Para el medio Agar de Dextrosa de Sabouraud, la carga microbiana fue significativamente más alta (< 0.10) en el semen crudo en comparación con CS+ y F-. No se encontraron diferencias significativas (< 0.10) en las muestras refrigeradas a las 48 horas. Independientemente de la presencia de antibióticos, los métodos de procesamiento evaluados, cuando se combinan con rigurosas medidas de higiene, mantuvieron la calidad del semen y redujeron la carga microbiana en la misma medida que un protocolo tradicional que utiliza antibióticos.