Reemplazar fertilizantes químicos parciales con fertilizantes orgánicos puede aumentar la entrada de carbono orgánico, cambiar la estequiometría de nutrientes del suelo y el metabolismo microbiano, y luego afectar el almacenamiento de carbono orgánico del suelo (COS). Se utilizó un experimento de campo de 6 años para explorar el mecanismo de almacenamiento de COS bajo diferentes proporciones de sustitución de estiércol en el noreste de China, con tratamientos que incluían la aplicación de fertilizantes químicos solos (nitrógeno, fósforo y potasio, NPK) y reemplazando 1/4 (1/4M), 2/4 (2/4M), 3/4 (3/4M) y 4/4 (4/4M) del nitrógeno del fertilizante químico con nitrógeno de estiércol. Se analizaron los nutrientes del suelo, la actividad enzimática y las fracciones de COS para evaluar el efecto de diferentes proporciones de sustitución de estiércol en el almacenamiento de COS. Una alta proporción de sustitución de estiércol (>1/4) aumentó significativamente el nitrógeno total del suelo, el fósforo total, el potasio total y los nutrientes disponibles (NO-N, P disponible y K disponible), y el 4/4M disminuyó considerablemente la relación C/N en comparación con el NPK. La incorporación de estiércol aumentó el carbono de biomasa microbiana (CBM) en un 18.3-53.0%. Los tratamientos con 50%, 75% y 100% de sustitución de estiércol (2/4M, 3/4M y 4/4M) mejoraron el carbono de necromasa bacteriana (CNB), el carbono de necromasa fúngica (CNF) y el carbono total de necromasa microbiana (CNM) en un 31.9-63.5%, 25.5-107.1% y 27.4-94.2%, respectivamente, en comparación con el tratamiento NPK. Notablemente, el aumento en CNF fue mayor que el de CNB a medida que aumentaba la proporción de sustitución de estiércol. La creciente sustitución de estiércol mejoró significativamente el carbono orgánico particulado (COP) y el COS total, pero no afectó el carbono orgánico asociado a minerales (COAM). Los altos suministros de N y P del suelo disminuyeron las actividades de leucina aminopeptidasas (LAPs) y fosfatasa alcalina, pero aumentaron la relación de actividad de beta-glucosidasa (BG)/(N-acetil-glucosaminidasa (NAG) + LAP). Los tratamientos con 25% de sustitución de estiércol (1/4M) mantuvieron el rendimiento de maíz y soja, pero con el aumento de la tasa de estiércol, el rendimiento de maíz disminuyó gradualmente. En general, la alta proporción de sustitución de estiércol mejoró el almacenamiento de COS al aumentar el COP y el CNM, y disminuir el potencial de descomposición del carbono de estiércol y del carbono del suelo resultante de las bajas actividades enzimáticas que requieren N y P bajo altos suministros de nutrientes. Este estudio proporciona evidencia empírica de que la sustitución racional de fertilizantes químicos por estiércol es una medida efectiva para mejorar la disponibilidad de nutrientes, y su efecto en el aumento de los rendimientos de cultivos aún necesita ser observado continuamente, lo que sigue siendo una opción beneficiosa para mejorar la fertilidad del suelo negro.