Los tumores mamarios son la neoplasia más frecuente en perras. Las líneas celulares mamarias caninas representan un modelo de estudio para la investigación del cáncer de mama en mujeres que podría beneficiar a ambas especies. El objetivo de nuestro estudio fue establecer y caracterizar parcialmente líneas celulares de tumores mamarios caninos. Se generaron diez cultivos celulares a partir de tejido tumoral obtenido de caninos con tumores mamarios. Se generaron siete líneas celulares a partir de tumores mamarios primarios y tres líneas celulares de sitios metastásicos. El análisis de inmunocitoquímica (ICC) reveló una expresión negativa de receptores hormonales (receptor de estrógeno [ER] y receptor de progesterona [PR]) en cinco líneas celulares y positiva en una línea celular, mientras que seis líneas celulares fueron negativas para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y positivas para vimentina. Varias líneas celulares mostraron capacidad de tumorigenicidad in vitro. La susceptibilidad de cinco líneas celulares a diferentes fármacos se evaluó con el ensayo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio), donde la doxorubicina (DOX) mostró el mayor efecto inhibidor del crecimiento (DOX > Paclitaxel > Colchicina > 5-Fluorouracilo [5-FU] > Carboplatino). Las líneas celulares generadas representan un modelo de estudio para el cáncer de mama que puede ser utilizado para desarrollar y probar nuevos tratamientos para mejorar la supervivencia de pacientes caninos y humanos.