La enfermedad del marchitamiento del pino (PWD), que representa un riesgo significativo para las plantaciones de pino en todo el mundo, es causada por el agente patógeno, también conocido como el nematodo de la madera del pino (PWN). Se desarrolló un ensayo de PCR digital en gota (ddPCR) para la identificación rápida del PWN con el fin de mejorar la sensibilidad de detección. Los hallazgos de la investigación indican que el ensayo ddPCR demostró una sensibilidad de análisis y de detección significativamente más alta en comparación con la PCR cuantitativa tradicional (qPCR). Sin embargo, tenía un rango dinámico más limitado. Ambas técnicas, ddPCR y qPCR, mostraron alta especificidad en el diagnóstico del PWN. Las evaluaciones de reproducibilidad revelaron que ddPCR tenía coeficientes de variación más bajos en cada concentración de plantilla. Las pruebas de inhibición mostraron que ddPCR era menos susceptible a los inhibidores. Hubo una fuerte asociación lineal entre las mediciones de plantilla estándar obtenidas utilizando ddPCR y qPCR (correlación de Pearson = 0.9317; < 0.001). Asimismo, hubo un fuerte acuerdo (correlación de Pearson = 0.9348; < 0.001) entre las mediciones de ddPCR y qPCR en la evaluación de muestras de madera de pino. Además, las muestras de madera de árboles de pino sintomáticos (100% frente a 86.67%) y asintomáticos (31.43% frente a 2.9%) fueron diagnosticadas con mayores tasas de detección utilizando ddPCR. Las conclusiones de este estudio destacan las ventajas del ensayo ddPCR sobre qPCR para la detección cuantitativa del PWN. Este método tiene un gran potencial para la investigación ecológica sobre PWD y su uso en cuarentenas.