En los seres humanos, la secuenciación completa del ADN mitocondrial (ADNmt) se ha utilizado ampliamente en muchos campos de investigación, incluyendo la medicina, la criminología y la genética. Con respecto al perro doméstico, que comúnmente se reconoce como un miembro adicional de la estructura familiar humana tradicional, se deberían desarrollar estudios de investigación sobre el ADNmt para expandir y mejorar nuestro conocimiento colectivo sobre la medicina y el bienestar canino, ya que parece que aún hay margen para un mayor desarrollo en estas áreas. Además, no se ha descrito en la literatura un método simple y robusto para la secuenciación completa del ADNmt que pueda aplicarse a varias razas de perros. En el presente estudio, nuestro objetivo es establecer un método para la secuenciación completa del ADNmt del perro doméstico. En los experimentos que realizamos, se utilizaron muestras de ADN de mucosa oral obtenidas de seis perros domésticos japoneses como plantilla. Diseñamos cuatro pares de cebadores que podrían amplificar aproximadamente 5 kbp de cada región del ADNmt y validamos varias condiciones de PCR. Posteriormente, los amplicones de PCR se agruparon y se sometieron a preparación de bibliotecas. La secuenciación de las bibliotecas se realizó utilizando secuenciación de nueva generación (NGS), seguida de un análisis bioinformático. Nuestros resultados demuestran que el método propuesto puede utilizarse para realizar una resecuenciación altamente precisa. Creemos que este método puede ser útil para futuras investigaciones realizadas para comprender mejor la medicina y el bienestar canino.