En las enfermedades neurodegenerativas, incluidas las enfermedades priónicas, los modelos celulares in vitro aparecen como herramientas fundamentales para el estudio de los mecanismos patogénicos y los compuestos terapéuticos potenciales. Los sistemas de cultivo celular en monocapa bidimensional (2D) son los ensayos basados en células más utilizados, pero estas plataformas no pueden reproducir el microambiente de las células in vivo. Esta limitación puede superarse utilizando sistemas de cultivo tridimensional (3D) como los esferoides que imitan de manera más efectiva las interacciones celulares in vivo. En este estudio, evaluamos el efecto de la infección por priones de scrapie en células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea ovina (oBM-MSCs) cultivadas en monocapa y en esferoides derivados de oBM-MSCs en condiciones de crecimiento y neurogénicas, analizando su viabilidad celular y su capacidad para mantener la infección por priones. Se realizó un ensayo MTT en oBM-MSCs y esferoides sometidos a tres condiciones: inoculados con homogeneizado cerebral de ovejas infectadas con scrapie, inoculados con homogeneizado cerebral de ovejas sanas y controles no inoculados. Las condiciones 3D mejoraron la viabilidad celular en la mayoría de los casos, aunque en los esferoides infectados por scrapie en condiciones de crecimiento, se observó una disminución en la viabilidad celular. Los niveles de proteína priónica patológica (PrP) en oBM-MSCs y esferoides infectados por scrapie se midieron por ELISA. En condiciones neurogénicas, las células en monocapa y los esferoides mantuvieron los niveles de PrP a lo largo del tiempo. Sin embargo, en condiciones de crecimiento, las oBM-MSCs mostraron niveles decrecientes de PrP a lo largo del tiempo, mientras que los esferoides pudieron mantener niveles estables de PrP. La presencia de PrP en los esferoides también fue confirmada por inmunocitoquímica. En conjunto, estos resultados muestran que un microambiente de cultivo 3D mejora la permisividad de las oBM-MSCs a la infección por scrapie en condiciones de crecimiento y mantiene la capacidad de infección en condiciones neurogénicas, lo que hace que este modelo sea de potencial uso para estudios sobre priones.