Los esferoides de células cancerosas colorrectales primarias y sus xenoinjertos en ratones han surgido como modelos preclínicos útiles para la investigación del cáncer, ya que replican las características del tumor de manera más fiel en comparación con las líneas celulares. Mientras que los modelos 3D proporcionan un sistema confiable para el descubrimiento y la prueba de fármacos, su complejidad estructural representa un desafío y sus relaciones estructura-función solo se comprenden parcialmente. Aquí, presentamos un análisis ultrastructural comparativo y citométrico de flujo de esferoides derivados de cáncer colorrectal de pacientes y sus xenoinjertos en ratones. Las observaciones ultrastructurales destacaron que los esferoides multicelulares y sus xenoinjertos contienen los mismos tipos de células cancerosas, pero con diferentes proporciones; específicamente, los esferoides multicelulares estaban enriquecidos en células con un fenotipo similar a células madre, mientras que los xenoinjertos tenían una mayor cantidad de células que contenían gotas lipídicas. El análisis citométrico de flujo para el marcador y la actividad de células madre mostró un enriquecimiento de la presencia y actividad de células similares a células madre en los esferoides, mientras que los xenoinjertos tuvieron la respuesta inversa. Nuestros resultados evidencian los efectos en las células cancerosas de diferentes microambientes in vitro e in vivo. Esas diferencias deben tenerse en cuenta al diseñar modelos experimentales innovadores para pruebas de fármacos personalizadas.