El presente estudio tiene como objetivo realizar una caracterización epidemiológica y molecular de la infección en una población infantil que asiste a centros de cuidado infantil en Medellín, Colombia. Se inscribieron un total de 265 niños de 0 a 5 años en cinco centros infantiles en sectores urbanos de Medellín, en el noroeste de Colombia. Se tomaron muestras de heces para identificar parásitos intestinales mediante examen directo, concentración Ritchie-Frick e identificación molecular por PCR convencional y identificación de subtipos (ST) mediante codificación de barras por PCR con posterior reconstrucción filogenética. Se calculó el índice Kappa para evaluar el acuerdo entre microscopía y PCR para el diagnóstico. La prevalencia de protozoos intestinales fue del 36.6% (97/265), siendo el protozoo parasitario más frecuente el 15.8% (42/265), seguido del 15.5% (41/265) y del 15.1% (40/265). La prevalencia de por PCR fue del 53.2% (141/265), los subtipos identificados fueron ST3 con un 30.5% (18/59), ST2 con un 23.7% (14/59), ST1 con un 20.3% (12/59) y con menor frecuencia, ST4 con un 5.1% (3/59), ST6 con un 1.7% (1/59) y ST16 con un 15.3% (9/59) alelo 162. Este estudio proporciona la primera caracterización genética de subtipos circulantes en una población de Medellín, Colombia, y también actualiza la epidemiología de subtipos en el mundo con la primera identificación de ST16 en humanos.