Los ensayos de neutralización de pseudotipos son herramientas poderosas para estudiar respuestas de anticuerpos funcionales contra virus en laboratorios de baja bioseguridad. Sin embargo, los protocolos descritos en la literatura difieren ampliamente en cuanto al material, reactivos y métodos utilizados para realizar estos ensayos y analizar los datos generados. Esto podría resultar en discrepancias entre los resultados de diferentes laboratorios, incluso cuando se analizan los mismos pseudotipos y las mismas muestras. Aquí, describimos detalladamente un protocolo experimental para realizar ensayos de neutralización de pseudotipos utilizando pseudotipos lentivirales que llevan hemaglutinina de influenza y expresan luciferasa de luciérnaga. También presentamos los pasos necesarios para analizar los datos y calcular la concentración inhibitoria media de las muestras analizadas. Este protocolo brindará apoyo para la validación y estandarización del ensayo de neutralización de pseudotipos para serología de virus de influenza. Además, servirá como punto de partida para el desarrollo de ensayos de neutralización de pseudotipos utilizando pseudotipos que llevan otras proteínas de envoltura viral.