Los ensayos de citotoxicidad con cultivos celulares pueden ser una alternativa para evaluar la toxicidad biológica de las aguas superficiales y pueden ayudar a mejorar el control de la calidad del agua. Este estudio comparó dos métodos para preparar medios de cultivo para la exposición de células Hep-2 a muestras de agua recolectadas del río Rolante, un afluente importante del río Sinos. La toxicidad se evaluó utilizando los ensayos de MTT y rojo neutro. Se utilizaron dos métodos para preparar los medios de cultivo. En el método 1, la muestra se diluyó a 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 (v/v, muestra/medio) en un medio de cultivo estándar; en el método 2, se utilizaron muestras de agua como disolvente para el medio de cultivo, que se preparó a concentraciones de 100, 80, 60, 40 y 20%. Luego, los cultivos semiconfluentes se expusieron a la prueba de medios durante 24 horas, y la citotoxicidad se determinó inmediatamente utilizando los ensayos de MTT y NR. La actividad mitocondrial (MTT) fue significativamente menor en todas las concentraciones con ambos métodos, excepto a 1:1000 en el método 1. Sin embargo, los resultados de viabilidad lisosómica (NR) revelaron citotoxicidad solo en la muestra 1:1 del método 1. Ambos métodos de preparación de cultivos fueron eficientes y sensibles al ensayo de MTT, pero el método 2 pareció ser más adecuado para el ensayo de NR. El río Rolante presenta contaminantes citotóxicos para las células Hep-2, lo que podría explicar la mala calidad del agua de la cuenca del río Sinos.