La amilina es una hormona peptídica pancreática que regula la homeostasis de la glucosa pero también se agrega para formar amiloide de islote en la diabetes tipo 2. Dada su función tanto en la salud como en la enfermedad, hay un renovado interés en la degradación proteolítica de la amilina por la enzima degradadora de insulina (IDE) y otros proteasas. Aquí, describimos el desarrollo y la caracterización detallada de tres nuevos ensayos para la degradación de la amilina, dos basados en una forma de amilina de roedor fluoresceinada y biotinilada (amilina de roedor fluoresceína-biotina, FrAB), que pueden ser utilizados para cualquier proteasa de amilina, y otro basado en un sustrato fluorogénico apagado internamente (amilina basado en FRET, FRAM), que es más específico para IDE. El sustrato basado en FrAB se puede utilizar en un protocolo basado en fluorescencia fácilmente implementado o en un protocolo basado en polarización de fluorescencia (FP) que es más adecuado para el cribado de alto rendimiento (HTS), mientras que el sustrato FRAM tiene la ventaja de permitir el monitoreo continuo de la actividad proteolítica. Los tres ensayos proporcionan datos altamente cuantitativos y son resistentes al DMSO, y el ensayo basado en FRAM y FP FrAB son ideales para aplicaciones de HTS.