La monitorización eficiente de reacciones es crucial para la adquisición de datos en estudios cinéticos y mecanicistas. Sin embargo, para conversiones de nucleósidos a sus correspondientes nucleobases, como se observa en reacciones de fosforilación de nucleósidos catalizadas enzimáticamente, el arsenal analítico actual no cumple con los requisitos modernos en cuanto a costo, velocidad de análisis y alto rendimiento. Aquí presentamos un ensayo basado en espectroscopía UV/Vis que emplea un algoritmo para desmezclado espectral en un formato de placa de 96 pocillos. El algoritmo se basa en el ajuste de espectros de referencia de nucleósidos y sus bases a espectros experimentales y permite la determinación de las relaciones nucleósido/nucleobase en solución con alta precisión. El procedimiento experimental incluye la dilución apropiada de una muestra en solución alcalina acuosa, transferencia a una placa de múltiples pocillos, medición de un espectro UV/Vis y posterior desmezclado espectral in silico. Esto permite la recopilación de datos de manera eficiente y reduce los costos en comparación con los análisis HPLC de última generación aproximadamente en un 5 veces, siendo 20 veces más rápido y ofreciendo una precisión comparable. Además, el método es robusto con respecto a errores de dilución y transferencia de muestra, ya que solo considera la forma espectral y no la intensidad absoluta. Puede aplicarse a todos los nucleósidos y nucleobases naturales e incluso a los no naturales, como se demuestra con varios ejemplos.