En una búsqueda de una técnica confiable, económica y versátil para ensayos cinéticos de alto rendimiento en el metabolismo de fármacos, decidimos recontratar un enfoque tradicional basado en la determinación de formaldehído (FA) formado en reacciones de desmetilación dependientes del citocromo P450. Después de evaluar varias técnicas fluorométricas para la detección de FA, elegimos el método basado en la reacción de Hantzsch con acetoacetanilida como el más sensible, robusto y adaptable a la implementación de alto rendimiento. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para utilizar nuestra nueva técnica para ensayos automatizados de desmetilaciones de fármacos dependientes del citocromo P450 y discutimos su aplicabilidad para el escaneo de alto rendimiento de las vías de metabolismo de fármacos en el hígado humano. Para investigar más a fondo nuestro método, lo aplicamos a la reevaluación de las vías de metabolismo de la ketamina, un anestésico disociativo y potente antidepresivo que se utiliza cada vez más en el tratamiento del síndrome de abstinencia alcohólica. Al investigar los parámetros cinéticos de la desmetilación de la ketamina por diez principales enzimas del citocromo P450 (CYP), demostramos que, además de las enzimas CYP2B6 y CYP3A, que fueron reconocidas inicialmente como los principales metabolizadores de la ketamina, también desempeñan un papel importante CYP2C19 y CYP2D6. Al mismo tiempo, la participación de CYP2C9 sugerida en informes anteriores se consideró insignificante.