Enriquecimiento selectivo libre de fármacos basado en toxinas dirigidas de células mamíferas con alta expresión de transgenes
Autores: Sato, Masahiro; Akasaka, Eri; Saitoh, Issei; Ohtsuka, Masato; Nakamura, Shingo; Sakurai, Takayuki; Watanabe, Satoshi
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2013
Acceso abierto
Artículo científico
2013
Enriquecimiento selectivo libre de fármacos basado en toxinas dirigidas de células mamíferas con alta expresión de transgenes
Categoría
Ciencias Naturales y Subdisciplinas
Subcategoría
Biología
Palabras clave
Transfección
Selección
Expresión del transgén
Gen de resistencia a fármacos
Clones
Vector de expresión
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 16
Citaciones: Sin citaciones
Casi todos los protocolos de transfección para células de mamíferos utilizan un gen de resistencia a fármacos para la selección de células transfectadas. Sin embargo, siempre requiere la caracterización de cada clon aislado en cuanto a la expresión del transgen, lo cual es laborioso y consume mucho tiempo. En el estudio actual, desarrollamos un método novedoso para aislar selectivamente clones con alta expresión del transgen sin selección por fármacos. Los fibroblastos embrionarios porcinos fueron transfectados con pCEIEnd, un vector de expresión que expresa simultáneamente la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y la endo-beta-galactosidasa C (EndoGalC; una enzima capaz de digerir el epítopo alfa-Gal en la superficie celular) tras la transfección. Después de la transfección, las células sobrevivientes fueron tratadas brevemente con IB4SAP (lectina BS-I-B específica del epítopo alfa-Gal conjugada con una toxina saporina). Luego, se permitió que las células tratadas crecieran en medio normal, durante el cual solo las células que expresaban fuertemente EndoGalC y EGFP sobrevivirían debido a la ausencia de epítopos alfa-Gal en su superficie celular. Casi todas las colonias sobrevivientes después del tratamiento con IB4SAP eran de hecho negativas para la tinción con BS-I-B, y también expresaban fuertemente EGFP. Este sistema sería particularmente valioso para los investigadores que deseen realizar una producción a gran escala de proteínas recombinantes terapéuticamente importantes.
Descripción
Casi todos los protocolos de transfección para células de mamíferos utilizan un gen de resistencia a fármacos para la selección de células transfectadas. Sin embargo, siempre requiere la caracterización de cada clon aislado en cuanto a la expresión del transgen, lo cual es laborioso y consume mucho tiempo. En el estudio actual, desarrollamos un método novedoso para aislar selectivamente clones con alta expresión del transgen sin selección por fármacos. Los fibroblastos embrionarios porcinos fueron transfectados con pCEIEnd, un vector de expresión que expresa simultáneamente la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y la endo-beta-galactosidasa C (EndoGalC; una enzima capaz de digerir el epítopo alfa-Gal en la superficie celular) tras la transfección. Después de la transfección, las células sobrevivientes fueron tratadas brevemente con IB4SAP (lectina BS-I-B específica del epítopo alfa-Gal conjugada con una toxina saporina). Luego, se permitió que las células tratadas crecieran en medio normal, durante el cual solo las células que expresaban fuertemente EndoGalC y EGFP sobrevivirían debido a la ausencia de epítopos alfa-Gal en su superficie celular. Casi todas las colonias sobrevivientes después del tratamiento con IB4SAP eran de hecho negativas para la tinción con BS-I-B, y también expresaban fuertemente EGFP. Este sistema sería particularmente valioso para los investigadores que deseen realizar una producción a gran escala de proteínas recombinantes terapéuticamente importantes.