La fosforilación de proteínas es una modificación post-traduccional ubicua que regula una gran cantidad de procesos intracelulares, lo que hace que su análisis sea crucial para comprender la dinámica intracelular. Los métodos comúnmente utilizados, como el etiquetado radiactivo y la electroforesis en gel, no proporcionan información sobre la localización subcelular. La inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para fosfoproteínas y el análisis posterior a través de microscopía permiten a los investigadores evaluar la localización subcelular, pero típicamente carece de validación sobre si la señal fluorescente observada es específica de la fosforilación. En este estudio, se propone un ensayo de desfosforilación en portaobjetos acoplado con tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para fosfoproteínas en muestras fijas como un enfoque rápido y sencillo para validar proteínas fosforiladas en su contexto subcelular nativo. El ensayo fue validado utilizando anticuerpos contra dos proteínas objetivo fosforiladas diferentes, la conexina 43 fosforilada en serina 373 y sustratos fosforilados de la proteína quinasa A, con una reducción drástica en la señal tras la desfosforilación. El enfoque propuesto proporciona una forma conveniente de validar proteínas fosforiladas sin necesidad de pasos adicionales de preparación de muestras, reduciendo el tiempo y esfuerzo requeridos para el análisis, al tiempo que se minimiza el riesgo de pérdida o alteración de proteínas.