SARS-CoV-2 infecta a los humanos y a un amplio espectro de especies animales, como mascotas, animales de zoológico y animales no domésticos. Monitorear la infección en animales es importante en términos del riesgo de transmisión entre especies y la aparición de nuevas variantes virales. Se necesitan pruebas diagnósticas económicas, rápidas, eficientes y sensibles para analizar la infección en animales. ELISA de sándwich de doble antígeno tiene la ventaja de ser multispecies y puede utilizarse para detectar infecciones causadas por patógenos que infectan a varios hospedadores animales. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un ELISA de sándwich de doble antígeno utilizando dos proteínas de SARS-CoV-2, N y RBD. Comparamos su rendimiento, al usar estas proteínas por separado, con un ELISA indirecto y con una prueba de neutralización de virus sustitutos. Se evaluaron controles positivos y negativos de una población de gatos (n = 31) para comparar todas las pruebas. Después de confirmar que el ELISA de sándwich de doble antígeno con ambas proteínas RBD y N tenía el mejor rendimiento (AUC = 88%), se ajustó el punto de corte utilizando muestras positivas y negativas de gatos, humanos (n = 32) y cobayas (n = 3). El uso de muestras de tigres (n = 2) y ratas (n = 51) mostró buena concordancia con los resultados obtenidos previamente utilizando la prueba de microneutralización. Además, se evaluó una cohorte de muestras de perros con estado de infección desconocido. Estos resultados muestran que el uso de dos proteínas de SARS-CoV-2 en el ELISA de sándwich de doble antígeno aumenta su rendimiento y lo convierte en un ensayo valioso para monitorear infecciones previas causadas por SARS-CoV-2 en diferentes especies animales.