Los hepatocitos y los organoides hepáticos (HOs) derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) son terapias celulares prometedoras para enfermedades hepáticas. La eliminación de los transgenes de reprogramación puede afectar el potencial de diferenciación de las hiPSCs en las tres capas germinales, pero no en hepatocitos y organoides hepáticos en la etapa de desarrollo tardío. En este trabajo, generamos hiPSCs a partir de fibroblastos humanos normales utilizando un vector lentiviral policistrónico excisable basado en la eliminación mediada por recombinasa Cre del cassette de reprogramación flanqueado por loxP. Al comparar las propiedades de las hiPSCs que portan transgenes y las libres de transgenes con el mismo fondo genético, los estados pluripotentes de todas las hiPSCs fueron bastante similares, como lo indica la expresión de marcadores pluripotentes, la formación de cuerpos embrionarios y la diferenciación tri-línea en vitro. Sin embargo, después de la diferenciación in vitro en hepatocitos, las hiPSCs libres de transgenes fueron superiores a las hiPSCs con residuos de transgenes. Curiosamente, la generación y diferenciación hepática de organoides hepáticos humanos (hHOs) se mejoraron significativamente mediante la eliminación de transgenes de las hiPSCs, como se observó por la regulación al alza de los marcadores de hígado fetal (CK19, SOX9 e ITGA6) y marcadores funcionales de hepatocitos (ASGR1, HNF4alpha, CYP1A2, CYP3A4 y AAT) al cultivarse en medios de diferenciación. Así, la eliminación de transgenes de reprogramación facilita la diferenciación de hiPSCs en células similares a hepatocitos y organoides hepáticos con propiedades de células progenitoras del hígado. Nuestros hallazgos proporcionan así información significativa sobre las características de los organoides hepáticos derivados de iPSC.