Los tumores malignos del sistema nervioso central (CNSMs) se clasifican entre los tipos de cáncer más agresivos y mortales. La baja supervivencia media en pacientes con CNSMs se explica en parte por las dificultades objetivas de las cirugías cerebrales, así como por la quimiorresistencia adquirida de las células de CNSM. La citometría de flujo es una técnica analítica con la capacidad de cuantificar el fenotipo celular y categorizar las poblaciones celulares en función de sus características. En la revisión actual, resumimos las metodologías de citometría de flujo que se han utilizado para estudiar diferentes aspectos fenotípicos de los CNSMs. Estos incluyen el análisis del contenido de ADN para la determinación del estado de malignidad y la caracterización fenotípica, así como las metodologías utilizadas durante el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Concluimos con la utilidad histórica y actual de la citometría de flujo en el campo, y proponemos cómo podemos aprovechar las metodologías actuales y futuras posibles en la lucha contra este tipo de malignidad tan temible.