Los proteasomas hidrolizan la mayoría de las proteínas celulares. La reacción estándar para determinar la actividad del proteasoma en lisados celulares u otros lugares contiene sustrato de péptido conjugado con AMC, ATP, Mg y DTT. El ATP y el Mg se incluyen para mantener la funcionalidad del proteasoma 26S. Sin embargo, la mayoría de los proteasomas celulares son proteasomas 20S, y los efectos del ATP en la degradación de sustratos fluorogénicos por complejos 20S son en gran medida desconocidos. Aquí, evaluamos el efecto del ATP solo o en combinación con Mg en la degradación de sustratos fluorogénicos conjugados con AMC por proteasomas 20S purificados. La degradación de sustratos utilizados para determinar las actividades del proteasoma tipo quimotripsina, caspasa y tripsina disminuyó gradualmente con el aumento de la concentración de ATP de 0.25 a 10 mM. Estos efectos no estaban asociados con el bloqueo de los sitios activos de la subunidad catalítica del proteasoma o alteraciones inespecíficas de la fluorescencia de AMC por el ATP. Sin embargo, la ralentización de la degradación del péptido inducida por el ATP fue rescatada por la adición de Mg. Además, la eficacia de degradación del sustrato fue proporcional a la relación Mg/ATP, siendo igual a los valores de control cuando se usaron concentraciones equimolares de las moléculas. Los resultados obtenidos indican que al evaluar la actividad del proteasoma, se deben considerar los efectos recíprocos del ATP y el Mg en la hidrólisis de sustratos fluorogénicos conjugados con AMC por los proteasomas 20S.