El gusano de seda doméstico es ampliamente estudiado como organismo modelo para la genética de los lepidópteros y tiene un valor económico en la producción de seda. Los gusanos de seda también tienen aplicaciones en las industrias biomédica y cosmética, y la producción de cepas mutantes mejora significativamente la investigación básica y aplicada de los gusanos de seda. En los últimos años, la tecnología CRISPR/Cas9 se está adoptando rápidamente como la herramienta molecular más eficiente para generar líneas de gusanos de seda que llevan mutaciones en genes específicos. Aquí ilustramos un flujo de trabajo completo y eficiente para tamizar, caracterizar rápidamente y seguir las mutaciones a través de las generaciones, permitiendo la generación de líneas que heredan de manera estable mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9. Este enfoque se basa en el uso de diferentes métodos moleculares, el ensayo de heterodúplex, la clonación seguida de secuenciación de Sanger y la PCR del sistema de mutación refractaria a la amplificación. El uso de estas metodologías en una combinación secuencial permite la identificación de mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en genes que se encuentran tanto en autosomas como en cromosomas sexuales, y la selección de individuos apropiados para fundar líneas mutantes estables. Este protocolo podría aplicarse además para tamizar mutaciones de CRISPR/Cas9 en insectos haploides.