La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) es una técnica indispensable para el estudio de los cromosomas en plantas. Sin embargo, los métodos tradicionales de FISH, como BAC, rDNA, repeticiones en tándem y FISH basado en sondas de secuencias repetitivas distribuidas, tienen ciertas limitaciones, incluyendo dificultades en la síntesis de sondas, baja sensibilidad, hibridación cruzada y resolución limitada. En contraste, el FISH basado en oligonucleótidos representa un método más eficiente para estudios cromosómicos en plantas. Las sondas de oligonucleótidos son diseñadas y sintetizadas computacionalmente para cualquier especie de planta con un genoma secuenciado y son adecuadas para secuencias de ADN simples y repetitivas, cromosomas enteros o segmentos cromosómicos. Además, las sondas de oligonucleótidos utilizadas en el experimento de FISH proporcionan alta especificidad, resolución y multiplexión. Además, las sondas de oligonucleótidos hechas de una especie son aplicables para estudiar otras especies genéticamente y taxonómicamente relacionadas cuyo genoma aún no ha sido secuenciado, facilitando estudios de cito-genética molecular de plantas no modelo. Sin embargo, hay algunas limitaciones de las sondas de oligonucleótidos que deben ser consideradas, como la necesidad de un conocimiento previo del proceso de diseño de sondas y problemas de señal de FISH con sondas más cortas de ruidos de fondo durante los experimentos de oligo-FISH. Esta revisión discute de manera integral la síntesis de sondas de oligonucleótidos de novo con un enfoque mayor en secuencias de ADN de copia única, preparación, mejora y factores que afectan la eficiencia del oligo-FISH. Además, esta revisión destaca aplicaciones recientes de oligo-FISH en una amplia gama de estudios cromosómicos de plantas.