Las proteínas no naturales son biomacromoléculas cruciales y se han aplicado ampliamente en la ciencia fundamental, materiales novedosos de biopolímeros, enzimas y terapéuticos. El sistema de síntesis de proteínas sin células (CFPS) puede servir como una plataforma sólida para sintetizar proteínas no naturales mediante la incorporación altamente efectiva y específica del sitio de aminoácidos no naturales (UNAAs), sin las limitaciones de la permeabilidad de la membrana celular y la toxicidad de los componentes no naturales. Aquí, describimos un método rápido y sencillo para sintetizar proteínas no naturales en el sistema CFPS basado en extracto crudo, con una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal no natural y ARNt supresor evolucionados de . Se utilizó la proteína verde fluorescente superfolder (sfGFP) y la -propargiloxifenilalanina (PaF) como proteína modelo y UNAA. La síntesis de sfGFPs no naturales se caracterizó mediante espectrofotómetro de microplacas, cromatografía de afinidad y cromatografía líquida-espectrometría de masas/masas (LC-MS/MS). Este protocolo proporciona un procedimiento detallado que guía cómo utilizar el poderoso sistema CFPS para sintetizar proteínas no naturales según la demanda.